生物安全与来源:生物安全等级为 2 级(BSL-2),具儿童感染倾向性,易引发儿童上呼吸道感染及继发并发症,操作需在生物安全柜内进行,器具使用后需 121℃高压灭菌 30 分钟。菌株分离自临床急性中耳炎患儿中耳分泌物样本,生物学特性与儿童呼吸道 NTHi 分离株高度一致,可模拟儿童感染状态下的定植黏附表型与致病行为。
形态与培养特性:革兰氏阴性球杆菌,具双因子营养依赖特征:
显微镜形态:菌体呈短球杆状(0.3-0.4μm×0.6-1.2μm),较成人感染株更短,单个或成对排列,无芽孢、无鞭毛,革兰氏染色呈均匀淡红色(易脱色,染色时间控制 15-25 秒),无荚膜;
培养要求:兼性厌氧,需 5%-10% CO?环境,最适培养基为巧克力琼脂、含 X/V 因子的儿童呼吸道菌选择性琼脂(添加抗生素抑制杂菌),最适温度 35-37℃,生长速度中等(24-48 小时形成菌落),普通营养琼脂不生长;
菌落形态:巧克力琼脂上呈圆形、表面光滑湿润、边缘整齐的浅灰白色半透明菌落(直径 0.4-0.8mm,小于成人感染株),质地柔软,挑取时易拉丝,无溶血现象,菌落呈 “小水滴状”(适配儿童样本低菌量检测场景)。
生化与药敏特性:生化反应具物种特异性:氧化酶阳性、触酶阳性,发酵葡萄糖、麦芽糖产酸不产气,不发酵乳糖、蔗糖;核心优势在于儿童感染适配药敏表型:对儿科常用药物(阿莫西林、阿奇霉素、头孢克洛)敏感(阿莫西林 MIC 0.25-0.5μg/mL),无耐药性(区别于成人耐药株),药敏结果与儿童临床治疗响应高度匹配,是儿科 NTHi 感染 AST 质控的可靠参照。
未开封状态:以冻干粉(真空包装,含 10^6-10^7 CFU / 支,含 X/V 因子与儿童菌株保护剂)或甘油菌悬液(20% 甘油,10^5 CFU/mL,-80℃专用)供应:
冻干粉:-20℃以下冷冻保存,长期(>6 个月)建议 - 80℃储存,严禁反复冻融(活菌率下降 70% 以上,破坏儿童菌株特有表型),保质期 3 年;
甘油菌:直接 - 80℃保存,室温暴露 20 分钟致活力下降 50%,保质期 2 年,解冻后一次性使用。
复苏后状态:复苏菌液(含 X/V 因子巧克力肉汤培养)2-8℃冷藏 5 天内使用;斜面培养物(含 X/V 因子巧克力琼脂斜面)2-8℃冷藏 2 周内传代,传代需 5% CO?环境,使用前需镜检确认短球杆状形态,并通过儿科常用药物药敏预实验验证敏感性。
复苏操作:生物安全柜内,冻干粉加 1mL 含 X/V 因子巧克力肉汤溶解,37℃ 5% CO?培养 24-48 小时;待菌液浑浊、镜检见短球杆菌,且巧克力琼脂形成 “小水滴状” 菌落时使用。
传代培养:挑取巧克力琼脂单菌落,划线接种新鲜平板,37℃ 5% CO?培养 24-48 小时;斜面保存后 2-8℃冷藏,传代≤3 代(避免菌体形态与药敏表型漂移),每次传代后需阿莫西林药敏测试验证敏感性。
应用操作:
儿科质控:验证儿童中耳分泌物、鼻咽拭子样本鉴定系统(质谱、快速生化试剂盒)对儿童 NTHi 的检出准确性;
儿科 AST 测试:校准阿莫西林、头孢克洛等儿科药物 MIC 值,指导儿童 NTHi 感染用药;
儿童感染研究:用于儿童 NTHi 黏附中耳上皮细胞机制研究,及儿科抗感染药物筛选;
试剂验证:验证儿童流感嗜血杆菌检测试剂(如快速抗原试纸)的敏感性,适配儿童低菌量样本检测需求。


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