温度：37℃±1℃（最适生长温度，低于 30℃或高于 42℃会抑制芽孢萌发）；
厌氧度：采用厌氧培养箱时，需通入氮气（90%）、氢气（5%）、二氧化碳（5%）混合气体，氧浓度控制在 0.1% 以下；若用厌氧袋，需加入厌氧产气包，确保袋内氧浓度＜0.5%；
培养时间：芽孢复苏需 48-72 小时，繁殖体培养 24-48 小时即可达到对数期。
芽孢活化（关键步骤）：取冻干芽孢粉，加入 2mL 无菌硫乙醇酸盐流体培养基，轻轻混匀（避免剧烈振荡引入空气），置于 37℃厌氧培养箱中预培养 24 小时（唤醒休眠芽孢，若直接接种易导致复苏失败）；期间需检查培养基是否浑浊，若未浑浊需补加 0.5mL 无菌庖肉提取液，增强营养供应。
增殖与纯化：取活化后的菌液 0.5mL，接种至庖肉培养基，37℃厌氧培养 48 小时，观察到培养基浑浊且产生气体后，取 0.1mL 菌液涂布血琼脂平板（厌氧培养），37℃培养 48 小时，挑取具有双层溶血环的单个菌落，转接至新鲜庖肉培养基，37℃厌氧培养 24 小时，制成种子菌液（此时以繁殖体为主，含少量芽孢）。
芽孢制备：将种子菌液按 1:5 比例接种至芽孢形成培养基（庖肉培养基中添加 0.1% MnSO??H?O），37℃厌氧培养 72-96 小时，直至显微镜观察芽孢形成率≥80%；通过离心（4000rpm，15 分钟）收集芽孢，用无菌生理盐水洗涤 3 次（去除繁殖体与培养基残渣），制成芽孢悬液（浓度可达 10?-10? CFU/mL）。
浓度校准：采用 “涂布计数法（厌氧培养）+ 芽孢染色计数法” 双重验证。取 1mL 芽孢悬液，用无菌生理盐水 10 倍梯度稀释至 10??、10??，取 0.1mL 涂布血琼脂平板（每个稀释度 3 个平行），置于厌氧培养箱 37℃培养 48 小时计数，计算平均菌落数与芽孢浓度，误差需控制在 ±0.2 log 内；同时，取稀释后的芽孢悬液进行孔雀绿芽孢染色，显微镜下计数芽孢占比，需≥80%，否则需延长芽孢形成培养时间。若误差超范围，需排查厌氧环境不达标、稀释吸管污染或芽孢活化不充分等问题。
形态与生化鉴别：
显微镜观察：革兰氏染色呈阳性粗大杆菌（直径 1-1.5μm，长度 3-5μm），无鞭毛，芽孢呈椭圆形，位于菌体次末端，不膨大（与其他梭菌如破伤风梭菌芽孢位于顶端且膨大鉴别）；
生化特性：能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖产酸产气（“stormy fermentation” 现象，即发酵迅速产生大量气体，使培养基剧烈翻腾）；不发酵甘露醇；明胶液化试验阳性（能产生明胶酶分解明胶）；硫化氢试验阳性（能分解含硫氨基酸产生硫化氢，使醋酸铅试纸变黑），这些特性可进一步确认菌株身份。
个人防护：人员需穿全包裹式防护服、戴 N95 口罩（防止吸入含菌气溶胶，虽为厌氧菌但操作中可能产生少量菌雾）、护目镜及双层无菌手套（外层手套需在生物安全柜内更换）；操作前后用 75% 乙醇消毒手部与防护服表面，若手部有伤口需覆盖防水创可贴。
环境与设备消毒：
生物安全柜：实验结束后，用 0.5% 过氧乙酸喷雾消毒内部，作用 30 分钟后用无菌水擦拭，再开启紫外灯照射 60 分钟（紫外线可杀灭残留繁殖体，芽孢需结合化学消毒）；
厌氧培养箱：每次使用后，用 1% 含氯消毒剂擦拭内壁，通入臭氧（浓度 0.3mg/L）消毒 30 分钟，再通入混合气体置换；
实验室环境：地面、墙面每周用 0.2% 过氧乙酸擦拭 1 次，下水道每月用 2% 氢氧化钠溶液冲洗 1 次，防止芽孢残留。
废弃物处理：含菌培养物（如庖肉培养基、芽孢悬液）需 121℃高压灭菌 60 分钟（芽孢耐高温，需比普通细菌延长 30 分钟，确保彻底杀灭）；含菌废液需先加入等量 20% 次氯酸钠溶液，室温静置 120 分钟（破坏毒素与芽孢结构）后再灭菌；实验耗材（如培养皿、吸头）需装入耐高温灭菌袋，灭菌后按医疗有害废弃物处理，不可与普通垃圾混放。
沙土管保存法（推荐）：取灭菌沙土（颗粒直径 0.2-0.5mm）装入试管，加入芽孢悬液至沙土完全湿润，振荡使芽孢均匀吸附，置于厌氧环境中室温干燥（避免接触空气导致芽孢活化），密封试管后 4℃冷藏存放，保质期可达 5-8 年，芽孢存活率≥85%。该方法能维持芽孢休眠状态，且操作简便，适合长期批量存储。
-80℃冷冻保存法：将芽孢悬液与 50% 无菌甘油（需提前通入氮气除氧）按 1:1 混合（甘油终浓度 25%，防止冷冻损伤），分装为 1mL / 支的冻存管，快速放入 - 80℃冰箱（避免缓慢冷冻形成冰晶破坏芽孢），冻存次数不超过 2 次（反复冻融会使芽孢存活率降至 50% 以下），保质期 3-4 年；解冻时需在厌氧环境中进行，避免氧气接触影响芽孢活性。
短期保存法（1-2 个月）：将纯化后的芽孢悬液接种至庖肉培养基，37℃厌氧培养 48 小时后，密封试管（用石蜡油封口，厚度 2-3mm，隔绝空气），4℃冷藏存放，每周需检查培养基是否变质，若出现异味或浑浊度下降需重新制备。
存储管理：需单独存放于双锁生物安全冰箱的厌氧菌专属区域，与需氧菌（如白色念珠菌、芽孢杆菌）严格分区（防止交叉污染与芽孢活化），标签需注明 “产气荚膜梭菌（ATCC13124，WDCM 00007）”“产 α 毒素”“芽孢悬液”“存储日期”，实行双人双锁领用制度；领用记录需详细注明用途（如 “厌氧消毒验证”“食品工艺测试”），领用后需在厌氧操作区使用，严防泄漏引发实验室感染或环境污染。
客服1