培养基选择与制备：推荐使用营养琼脂（NA）或胰酪大豆胨琼脂（TSA），典型菌落呈乳白色、扁平、边缘不整齐，表面粗糙（与金黄色葡萄球菌光滑菌落差异显著）；若需诱导芽孢形成，需采用芽孢形成培养基（含 0.1% KCl、0.02% MgSO?、0.01% MnSO?），锰离子可促进芽孢壁合成。制备芽孢形成培养基时，需注意 pH 调节至 7.2~7.4（偏中性环境利于芽孢形成），灭菌后避免反复加热，防止营养成分降解。
复苏与浓度校准技巧：冻干菌粉（含芽孢）复苏时，需用无菌生理盐水（0.9% NaCl）溶解，80℃水浴加热 10 分钟（热休克处理，打破芽孢休眠状态，此步骤为芽孢菌特有操作），随后迅速冷却至 37℃，转接至 TSA 平板，37℃培养 24~48 小时（芽孢萌发及菌体繁殖周期长于普通细菌）。若浓度偏离 log4 级别（误差＞±0.1 log），需排查热休克温度或时间是否不当（温度过高会杀灭芽孢，过低则无法有效萌发）或涂布量是否精准（建议取 0.1mL 复苏菌液，采用倾注法计数，避免芽孢附着平板表面导致计数偏低）。
芽孢纯度检测操作要点：挑取 TSA 平板上的典型菌落，接种至芽孢形成培养基，37℃振荡培养（150rpm）72 小时，取菌液涂片，用孔雀绿 - 番红染色法染色（芽孢呈绿色，菌体呈红色），显微镜下观察芽孢比例需≥90%（符合标准菌株芽孢纯度要求）。若芽孢比例不足，需延长培养时间（芽孢形成需 72 小时以上）或调整培养基中锰离子浓度（浓度过低会抑制芽孢形成）。
安全管控等级：该菌株属非致病性菌，BSL-1 实验室即可操作，气溶胶操作无需生物安全柜（常规超净台即可），操作人员仅需佩戴无菌手套，因芽孢无毒性，无需特殊防护（与金黄色葡萄球菌高致病性管控差异显著）；实验结束后用 75% 乙醇擦拭操作台面，作用 5 分钟即可，无需复杂消毒流程。
废弃物处理要求：含菌培养物（含芽孢）需 121℃高压灭菌 30 分钟（芽孢耐高温，需延长灭菌时间，普通细菌 20 分钟即可），确保芽孢彻底杀灭；实验耗材（如吸头、培养皿）灭菌后可按普通废弃物处理；含芽孢废液无需额外化学消毒，灭菌后可直接排放（因芽孢无致病性，且灭菌后无活性）。
长期存储技巧：长期保存建议采用冻干法（含 10% 脱脂乳 - 5% 蔗糖保护剂，保护芽孢结构完整），4℃干燥避光存放，保质期可达 8~10 年（远长于普通细菌）；若采用 - 80℃甘油冷冻法，需将含芽孢菌液与 50% 无菌甘油按 1:1 比例混合（甘油终浓度 25%，避免芽孢脱水），分装后快速冷冻，无需担心反复冻融（芽孢耐冻性强，普通细菌反复冻融会导致菌体死亡）。存储时可与非致病性菌株同区域存放于普通双锁冰箱，标签注明 “非致病性斯皮兹泽芽孢杆菌（ATCC6633，WDCM 00003）”“log4 浓度（芽孢）” 及存储日期，建立常规领用台账，管理难度低于致病性菌株。
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